Микрофотография
1 пост
Dr.Hannibal
Доктор, учёный и лектор.
171К
рейтинг
3746 подписчиков
32 подписки
60 постов
37 в горячем
Награды:
Серии постов
Ответ на пост «Передачка»3
К вопросу если человек оступился, и можно ли ему дать второй шанс. У меня знакомый, зимой поехал с подругой и компанией отдохнуть с ночевкой в коттеджный поселок за городом, выпить, пожарить шашлыков и по крайней мере в его голове позаниматься любовью. Но подруга его энтузиазма не разделила, напилась в хлам и стала зажигать с другим парнем. Все мы были подростки 18-20 лет. Был небольшой скандал и знакомый решил ехать домой и подругу заодно отвезти. Что именно там у них в машине произошло неизвестно. Я остался в коттедже. Факт в том, что высадил он эту подругу среди ночи на пустой лесной дороге в -30. Приятель потом уверял, что они поссорились в машине из за ее поведения на вечеринке и она заявила, что ехать с ним в машине не хочет. Он остановился она вышла, он уехал. Через минут 15 решил вернуться, но на прежнем месте ее не нашел, (или место не нашел Навигаторов тогда не было. Или не ездил он назад вовсе, кто знает?) решил, что она уехала на попутке и поехал горевать по своей неудачной личной жизни домой. Подругу нашли только весной когда стаял снег, в сугробе у обочины. Тело за 3 месяца изрядно разложилось, так что хотя причину смерти установили как воздействие низких температур, достоверно установить например факт соития или наличие мелких травм не представлялось возможным. Приятель разумеется все отрицал. Обвиняли его по 131 и 105, но в итоге переквалифицировали в 125 (оставление в опасности), по которой он отсидел год. В принципе очень понятный образованный человек, не смотря на судимость сделал карьеру в строительной индустрии, женился, двое детей. Никогда ни до ни после ни в каком криминале он замешан не был,
Изнасиловал и убил он эту девушку и прикопал ее в сугробе? Или это действительно прискорбное стечение обстоятельств? Пьяной девушки на эмоциях, которая не подумала, что остаться одной на лесной дороге, при таком холоде в городской осенней курточке равносильно самоубийству, мужчины с уязвленным самолюбием который тоже об этом не подумал и сказал «Не хочешь ехать иди пешком». Не знаю.
Микроглия как ключ к лечению Глаукомы и болезни Альцгеймера1
Сколько там ещё у меня есть? Пять лет, десять, двадцать? Да неважно! Я всё могу! Я повернулся к охранникам, засмеялся. Мне хотелось спросить их, чего хотят они. Я всё могу сейчас сделать! Я всё исполню! Я полон волшебства!
Маги без времени (с) Сергей Лукьяненко
Когда я не занимаюсь всякой ерундой вроде вживления чипов в свою руку я иногда занимаюсь и серьёзными исследованиями. Моя работа уже подарила миру синтетическую роговицу для борьбы с кератоконусом, настало время заняться по настоящему серьёзными проблемами. Меня несколько раз спрашивали о новых антителах против Амилоида-бета для лечения болезни Альгеймера, наша работа показывает, что скорее всего эти антитела окажутся малоэффективными, потому, что Амилоид не причина, а следствие, а причина глаукомы и болезни альцгеймера - активация микроглии.
Последние семь лет своей жизни я сжёг, отвечая на один интересный вопрос: почему микроглия не съедает наш мозг и сетчатку? На самом деле, я шёл к этому гораздо дольше, наверное, всю свою жизнь, со всеми её взлётами и падениями.
Я знаю очень странный вопрос и в то же время принципиально важный. Дело в том, что у мозга и сетчатки есть своя независимая иммунная система, состоящая из микроглиальных клеток. Вы когда-нибудь задумывались, зачем мозгу нужна своя изолированная иммунная система? Ответ плавает на поверхности, потому что мозгу нужно защищаться от инфекций – не верный. Да, когда падёт гематоэнцефальный барьер, микроглия встанет в строй и будет драться до последней живой клетки, но любая инфекция в мозгу – это уже заведомо катастрофа. Менингит или энцефалит даже сейчас имеют сравнительно высокую летальность, а до периода современной медицины так и вовсе были смертельны. Эволюционно такая иммунная система не закрепилась бы. Так зачем она нужна?
Микроглия в сетчатке человека: окрашивание IBA-1 (зелёный), IGFBPL1 (красный), DAPI (синий). (c) Dr. Hannibal
На самом деле, микроглия в первую очередь нужна для того, чтобы поедать наше прошлое. Каждое воспоминание — это множество нейронных связей. Если связь ослабевает, на поверхности аксонов станет меньше протеинов “не ешь меня” (да, они так и называются), и микроглия пожирает эту связь, иногда вместе с нейроном. Микроглия также утилизирует больные и погибшие нейроны. Каждый день свыше десяти тысяч нейронов в вашем мозгу погибают.
Вы задумывались, почему так смутно помнится далёкое прошлое? Воспоминания не ушли до конца, часть нейронных связей ещё функционирует, но сохранились только яркие события, которые сформировали множество сильных нейронных связей. События маловажные давно исчезли, и никакой гипноз их не вернёт. Микроглия просто сожрала эти связи. Более того, даже яркие события со временем трансформируются. Каждый раз, когда вы вспоминаете что-то, возникают новые нейронные соединения. Зачастую это экстраполяции. Поэтому наша память со временем становится не столько воспоминаниями, сколько фантазиями о воспоминании, основанном на оригинальном событии. Впрочем, это совсем другая история.
Не подумайте, что это плохо. Я сначала тоже думал, может быть лучше, чтобы микроглии не было вовсе? Есть несколько методов, как её можно из мозга и сетчатки убрать. Нет, не лучше. Без микроглии хаотичное формирование нейронных соединений быстро ведёт к нарушению когнитивных функций.
Микроглия пожирает синапсы. Окрашивание IBA-1 (зелёный), нейроны B-III-Tubulin (красный). Open access research “Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury” by Geoffrey T. Norris, et al. Journal of Experimental Medicine. Published June 25 2018. doi:10.1084/jem.20172244
Что же происходит при болезни Альцгеймера и глаукоме, что общего между всеми этими заболеваниями? Есть множество мнений, но наша группа сфокусировалась на активации микроглии. Активированная микроглия становится агрессивной и начинает пожирать нейроны вне зависимости от сигналов на их поверхности. Активация микроглии — процесс с позитивной обратной связью: чем больше активной микроглии, тем больше активации микроглии. Микроглия также может размножаться, и при болезни Альцгеймера и глаукоме, болезнях, медленно, но верно пожирает мозг или сетчатку, нейрон за нейроном. Дело ведь вовсе не в повышенном внутриглазном давлении; дело в микроглии. И в то же время в здоровом мозге микроглия имеет механизмы возврата в гомеостатическое состояние. Иначе мельчайшие травмы или радиационный фон запустили бы необратимый процесс пожирания мозга микроглией ещё в раннем детстве. В то же время в клеточной культуре активированную микроглию невозможно вернуть обратно в гомеостатическое состояние. Это необратимый процесс, но так ли он необратим?
Должен же быть какой-то молекулярный ключ к этим наномашинам? Долгие годы сгорели в реверсивной генетике. Нужно взять мышей, у которых глаукома развивается спонтанно, и скрестить их с обычными, а годами секвенировать ДНК и наблюдать мутации в тех генах, которые совпадают с развитием глаукомы. Это ужасно скучная и неблагодарная работа, практически без начала и конца, с очень смутной надеждой на то, что из неё что-то получится. Но, в конечном итоге, статистика начала набираться, и в океане шума замаячили гены-кандидаты. Несколько сотен генов-кандидатов. Нужно было их тестировать, но как? Микроглия не желает расти в клеточной культуре. Даже если извлечь эти клетки из мозга или сетчатки, они активируются и умирают через несколько дней
Здоровая культура микроглии мозга.
Ещё два года моей жизни ушли на разработку клеточной культуры микроглии. Нужно было подобрать среду, факторы роста, процедуры удаления активированных клеток. Каждый эксперимент требовал несколько недель, так что количество попыток было ограничено. Создание культуры само по себе было удивительно интересным проектом.
Теперь у нас была рабочая культура микроглии, и её можно было активировать экстрактом бактериальных липополисахаридов и давать протеин-кандидат. Как правило, ничего не происходило, микроглия оставалась активной. Ещё полтора года поисков, множество неудачных экспериментов. Наконец, группа клеток, которым я дал белок-кандидат IGFBPL1, показала полный возврат к гомеостатическим функциям после дозы бактериального липополисахарида
Моллекулярная структура IGFBPL1, ключь к деактивации микроглии.
Часть IGFBPL1 похожа на инсулин, поэтому он может взаимодействовать с инсулиновыми рецепторами IGF1R. Как показали опыты, блокада IGF1r полностью аннулирует эффект IGFBPL1 микроглия остаётся активной.
Экспрессия белка воспаления COX-2 в культуре микроглии, стимулированной липополисахаридом LPS в мышинных и человеческих клетках микроглии HMC-3 в культуре. Кстати, ингибитор COX-2 – это обычный аспирин, который вы принимаете при простуде. Добавление IGFBL1 драматически снижает экспрессию COX-2. Блокада рецептора IGF1r с помощью синтетического ингибитора аннулирует эффект IGFBPL1, подтверждая, что IGFBPL1 действует именно через IGF1r. Впервые в истории удалось вернуть активированную микроглию в гомеостатическое состояние после активации. Это было непередаваемое чувство, когда я впервые взглянул через микроскоп на эти клетки. Я не мог поверить, искал ошибку, но ошибки не было. Мы раз за разом повторяли эксперименты, и результат оставался тем же
Введение микрочастиц MB в глаз мыши в модели глаукомы. Панель А показывает повышение внутриглазного давления. Панель B демонстрирует морфологию микроглии в окрашивании IBA-1 в сетчатке контрольных, глаукоматозных мышей с введением неактивного раствора PBS и глаукоматозных мышей с введением белка IGFBPL1. Введение IGFBPL1 в глаз не оказывает влияния на внутриглазное давление, но возвращает микроглию в неактивное состояние.
Результаты секвенирования РНК одиночных клеток методом Single Cell Sequencing микроглии сетчатки из глаз контрольных мышей (А), мышей с абляцией IGFBPL1 (KO), мышей с глаукомой с введением PBS (неактивный раствор) MB+PBS и мышей с глаукомой и введением белка IGFBPL1 (MB+IGFBPL1). Алгоритм виртуального времени (новейшая разработка последних лет) показывает динамику перехода клеток из одного состояния в другое. Красная стрелка указывает вектор активации микроглии, зелёная – деактивации. Как вы можете видеть, инъекция IGFBPL1 дает мощный вектор к деактивации.
Контрольные (WT) и трансгенные мыши с абляцией IGFBPL1 (KO). Отсуствие IGFBPL1 показывает гибель нейронов сетчатки, прогрессирующую со врменем (окрашивание BRN3a) A-C. Активация микроглии в сетчкатке KO мышей D-F. Повышение патологического белка Tau в гиппокампе KO мышей, схожее с болезнью альгеймера G-J.
Метод оценки зрения у мышей с использованием непроизвольного движения головы при демонстрации движущихся линий (A, E). В эксперименте используются мыши с глаукомой, вызванной микрогранулами. Введение IGFBPL1 сохраняет зрительные функции у мышей в экспериментах по электрофизиологии сетчатки (ERG) (C), оценке зрения в поведенческих опытах (D, E) а также сохраняет нейроны сетчатки в окрашивании препаратов BRN3a (F, G), и все это без влияния на внутриглазное давление (B).
Таким образом, мы доказали, что введение IGFBPL1 прекращает потерю нейронов у мышей с глаукомой. Это также подтверждает, что глаукома развивается из-за активации микроглии в ответ на повышение внутриглазного давления или из-за недостаточной системы деактивации микроглии (кроме IGFBPL1, вероятно, существуют и другие протеины; мы просто нашли один). Наша статья также объясняет механизм глаукомы при нормальном давлении, когда внутриглазное давление не повышено, но потеря нейронов сетчатки и зрения происходит из-за спонтанной активации микроглии. Глаукома с нормальным давлением также ассоциируется с высокой частотой болезни Альцгеймера
Наблюдается накопление патологического протеина Тау в нейронах сетчатки мышей с недостаточностью IGFBPL1 (KO). Также наблюдается накопление амилоид-бета в гиппокампе (мозге) мышей с недостаточностью IGFBPL1.
Мыши с недостаточностью IGFBPL1, как системной, так и специфической в микроглии, демонстрируют спонтанную активацию микроглии, симптомы болезни Альцгеймера и гибель нейронов мозга и сетчатки. Регулярные введения IGFBPL1 в глаза при глаукоме полностью прекращают потерю зрения, не влияя на внутриглазное давление. Теоретически, для лечения болезни Альцгеймера можно вводить IGFBPL1 каждые 2-3 месяца в спинномозговую жидкость. Впереди ожидает большая работа по исследованию безопасности и переносимости. Существует ряд проблем с человеческим IGFBPL1, такие как стабильность. Это возможно объясняет, почему у людей есть болезнь Альцгеймера, а у мышей она естественным образом не возникает. Мышинный IGFBPL1 в десятки раз стабильнее человеческого. К счастью, мышинный IGFBPL1 взаимодействует с человеческими клетками, также существует прогресс по созданию синтетического аналога IGFBPL1. Главное, что механизм деактивации найден, теперь нужно просто научиться лучше с ним работать для создания лекарства, которое можно будет применять на людях. Важно помнить, что IGFBPL1 может прекратить дальнейшее повреждение мозга или сетчатки, но не способен вернуть утраченные нейроны.
Само собой разумеется, что это упрощенное изложение из полной научной публикации, опубликованной в журнале Cell Reports в текущем месяце. Я упустил множество данных, так как они могут быть сложны для понимания широкой аудитории. Даже данное изложение, возможно, может быть сложным для непосвященных. Я старался использовать доступный язык. Полный текст статьи (на английском языке) доступен здесь:
IGFBPL1 is a master driver of microglia homeostasis and resolution of neuroinflammation in glaucoma and brain tauopathy
Published online: July 31, 2023
Accepted: July 12, 2023
Received in revised form: March 8, 2023
Received: July 5, 2022
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112889
Этот проект - огромный труд очень многих людей, который занял почти десятилетие. Я надеюсь, этот проект сможет спасти разум и зрение миллионов людей, а значит, всё было не зря. Не знаю, хватит ли меня ещё на что-то подобное, я очень выгорел на последних двух проектах, но наука - это марафон без конца, завершение и публикация одного проекта всего лишь означает начало нового, так как нет предела познанию. Эти исследования уже в разработке.
Спасибо, что дочитали до конца.
Показать полностью
12
Cyberpunk 2023: Мой первый кибернетический имплант1
Технология RFID-имплантов существует довольно давно. RFID (Radio Frequency Identification) - это технология идентификации с использованием радиочастот. Главное её преимущество - это отсутствие необходимости в источнике питания. Радиоволны, принимаемые антенной чипа, обеспечивают достаточно электричества для его работы. Чип запитывается от радиосигнала и передаёт информацию, как правило, свой идентификационный номер. На этом, по большей части, и построены транспортные карты и системы доступа. В зависимости от модели, RFID-чип может быть как только для чтения, так и перезаписываемый. Если взять вашу кредитную карту и посмотреть на неё под ярким светом, можно разглядеть чип и антенну.
За последние 10 лет RFID-чипы распространились повсеместно, в картах безконтактной оплаты, мобильных телефонах. Идея установить себе RFID-имплант у меня возникала ещё лет десять назад со времён Японии и проездной карты Sapica. Примерно в то же время появились безконтактные кредитные карты. Технология была доступна, но явно рассчитана на карты, а не импланты в собственное тело. У карт был ограниченный срок действия, поэтому каждые несколько лет чип пришлось бы извлекать и устанавливать новый. Собственно, несмотря на доступность и удобство, идея внедрить себе под кожу компьютерный чип у многих вызывает отторжение. Думаю, именно психологический барьер стал, пожалуй, главным препятствием для более широкого внедрения этой технологии среди людей. Домашних животных чипируют давно и в промышленных масштабах. На работе у меня очень много разных дверей и терминалов, завязанных на мою карту доступа, поэтому пришла идея не таскать везде бейдж, а имплантировать себе чип с кодами бейджика.
Разумеется прежде чем заказывать себе имплант, нужно разобраться как вы будите копировать ваш ключ доступа или карту. В идеальном мире можно было бы поговорить со службой безопасности где ваш имплант просто могли бы зарегестрировать под вашим именем, но мы не живём в идеальном мире так в такой ситуации вас скорее всего просто не поймут. Я уже довольно давно пользуюсь Flipper Zero https://flipperzero.one/ про него ещё были публикация на Пикабу. Но на самом деле есть много различных устройств для считывания записи и расшифровки RFID чипов, на том же Ali Express их масса, поэтому ещё до момента заказа импланта мы исходим из того что вы уже разобрались как копировать ваш чип доступа ключи которого пойдут в имплант.
Хорошо видно витки 125 kHz антенны внутри хирургического стекла.
Для начала мне нужен был RFID чип пригодный для имплантации, можно было конечно иплантирвать себе чип который мы устанавливаем особо ценным мышам в лаборатории, технология практически та же самая, но там модуль высокочастотный 13.56 MHz и не перезаписываемый, а мне требовалась 125 kHz с чтением и записью. В конечном счёте выбор пал на xEM RFID модуль вместе с иньектором. https://dangerousthings.com/product/xem/
В России, что-то подобное можео купить на Ali Express главное заранее выяснить частоту считывателей с которыми вы хотите ваш имплант использовать и убедитесь что имплант придёт стерильный (или у вас есть возможность его стерилизовать). Имплантация не стерильного чипа может привести к серьёзным осложнениям. На сайте dangerousthings.com есть масса разных вариантов, чипы которые работают с 13.56 и 125 kHz одновременно, чипы со встроенным термометром и безконтактной передачей температуры.
Мне понравилась идея чипов со встроенным светодиодом которые загораются в момент считывания.
Набор пришёл в симпатичной коробке.
Здесь я достал чип из иньекционного устроства чтобы вам показать, но вам так делать ни в коем случае нельзя, я могу создать стерильные условия и перезарядить чип обратно в иньектор, вы скорее всего нарушите стерильность.
Кроме собственно чипа с иньектором в наборе шли:
1. Нестерильные перчатки
2. Стерильное одноразовое хирургическое покрывало.
3. Стерильные салфетки
4. Дезенфицирующие салфекти с этиловым спиртом.
5. Брелок в виде RFID антенны и светодиода позволяющий обнаруживать RFID поля.
6. Карточка идентификатор частоты считывающего устройства в зависимости от частоты загорается один из светодиодов на правой и левой стороне карточки.
7. Накалейка на машину чтобы все знали, что вы идиот киборг первого уровня.
Если вы решили повторить дальнейшие действия, то вы действуете на свой страх и риск. В идеале лучше всего, если имплантацию вам проведёт человек с медицинским образованием, но это не так просто устроить. Можно обратиться в салон пирсинга и татуажа, но там тоже, как повезет, можно встретить непонимание и нежелание сотрудничества. В целом, процедуру вполне можно выполнить самостоятельно.
Кстати, в Массачусетсе имплантация электронных устройств считается уголовным преступлением, но только если делать её кому-то и за деньги, самому себе можно. Уж не знаю, чего власти пытались этим добиться.
Особой жести дальше не будет но если вы боитесь игл и иньекций, следующие фотографии могут доставить вам дискомфорт.
К сожалению сам момент имплантации мне заснять не удалось, у меня были заняты обе руки.
Собственно, процедура:
Наденьте перчатки, да они не стерильные, но всё-таки лучше чем голые руки.
Откройте и разложите стерильную драпировку.
Снимите с инъектора оранжевый блокиратор, который препятствует движению поршня для вывода чипа. Если спохватитесь уже после введения иглы, снять блокировку может быть достаточно трудно, особенно если вы имплантируете чип самостоятельно.
Процесс имплантации заключается в обезараживании места инъекции салфетками с этиловым спиртом и введении иглы, она достаточно толстая, где-то 12G. Наилучшее место введения - это пространство между большим и указательным пальцами. Кожу обязательно нужно взять в складку, иначе есть риск напутать с углом введения и установить чип слишком поверхностно или слишком глубоко. Поскольку чип я имплантировал самостоятельно, мне очень помог канцелярский зажим для бумаг.
Если у вас низкий порог болевой чувствительности, можно обработать место введения иглы лидокаином. У меня стерильного лидокаина не было, только капли для глаз, но у меня высокий болевой порог.
Самый болезненный момент - это прокол кожи. Если не получилось с первого раза, можно ненадолго прерваться и продолжить введение иглы в уже образовавшийся канал. После прохождения кожи, продвижение иглы сквозь подкожную жировую клетчатку будет намного проще и гораздо менее болезненным, так как в этой части тела мало нервных окончаний. Постарайтесь ввести иглу как минимум на 80% длины.
Не имплантируйте чип слишком поверхностно. Да, такой чип легче считывать, но он будет вам мешать и легко может травмироваться и воспалиться. При оптимальной установке чипа он не должен чувствоваться вообще. В целом процесс установки намного менее болезненный, чем я опасался, с единственным неприятным моментом прокола кожи.
Когда ввели иглу достаточно глубоко, медленно начинайте давить на поршень. Вы почувствуете, как чип входит в ваше тело. Если чувствуется дискомфорт, иглу можно немного отвести назад, чтобы создать больше пространства для чипа. Когда поршень выжали до конца, чип уже в вашем теле.
Выньте иглу и прижмите место укола стерильной салфеткой, может быть очень незначительное кровотечение.
Собственно процедура завершена, осталось только заклеить место иньекции пластырем и проверить считывание чипа. Старайтесь не мочить руку около суток.
Следующие несколько дней может ощущаться незначительный дискомфорт в месте иньекции, но потом он пройдёт и вы никак не будите чувствовать что в руке у вас электронное устройство. Кроме собственно открывания дверей можно настроить авторизацию в компьютере, RFID замок в квартире, и насколько хватит фантазии применения нового импланта. Возможно со временем одного импланта вам покажется мало и задумаетесь об установке ещё одного в другую руку или другую часть тела. Например хорошо подходит зона запястья, главное не имплантируете чипы одинаковой частоты слишком близко друг к другу они будут конфликтовать.
Внимание: Если спустя несколько дней место инъекции покраснело, воспалилось и причиняет вам серьезный дискомфорт, необходимо обратиться к врачу. Вероятно, вы занесли инфекцию при установке чипа. Если это произошло лучше всего удалить чип и принять курс антибиотиков. Попробовать снова можно спустя несколько месяцев после того, как рука заживет, или установить чип в другую руку.
Обратите внимание: если вам придется проходить MRI (магнитно-резонансное исследование), чип придется извлечь, иначе магнитное поле проделает это безконтактно, но чип при этом будет быстро вращаться и разогреется до нескольких сотен градусов. В общем, скорее всего, ничего страшного не произойдет, но вам может не понравиться.
Чип может фонить в аэропорту при прохождении предполетного контроля и на металлодетекторах с максимальными настройками чувствительности. Обычно это не вызывает особых проблем. Сотрудники безопасности аэропорта часто сталкиваются с ложными срабатываниями своих устройств, наверное лучше не вдаваться в детали насчёт вашего импланта.
Всем успешных имплантаций!
Показать полностью
12
Моя работа молекулярный биолог
Здесь я работаю над лечением глаукомы и болезни Альцгеймера.
Как фильм "Эффект Бабочки" испортил мне отношения
Дело было лет 20 назад, в времена мед института у меня была однокурсница, допустим её звали Наташа. Перевела она наши отношения из дружеских в интимные очень лихо, пригласив меня на фильм ужасов "Проклятье" где якобы от страха прижималась ко мне всем телом весь фильм. Девушки берите на заметку если ваш потенциальный бойфренд намёков не понимает. Тут даже до достаточно толстолобого меня дошло, что я ей нравлюсь. Отношения были классные, очень легкие, непренуждённые, мне никогда ни до ни после не было так легко с человеком. Самое интересное в университете она так и оставалась неприступной отличницей в очках с толстыми стёклами, но когда мы оставались вдвоём очки отлетали в угол комнаты вместе с остальной одеждой. Мы гуляли, ели пиццу, играли в бильярд, путишествовали, иногда целые выходные не вылезали из постели и просто наслаждались компанией друг друга. Мне тогда казалось я нашёл ту самую, с которой могу провести свою жизнь и думал после нового года предложить ей съехаться вместе. Развалилось всё черезвыйчайно нелепо и только лет десять спустя я понял, что произошло. Не задолго до нашего романа в кинтеатре я посмотрел фильм "Эффект Бабочки" и мне фильм очень понравился. Я хотел чтобы Наташа тоже к нему приобщилась, но она на новый год уезжала к родителям. Я подумал, что это будет интересный подарок и купил ей коллекционное издание фильма, запечатанного в плёнке. Особенно отметив, что мне понравилась и впечатлила концовка. Мы очень мило созванивались когда она была у родителей, а потом связь внезапно оборвалась. Когда я всё-таки встретился с ней в институте, её как подменили, она крайне холодно мне сказала, что я какой-то ебанутый раз подарил ей такой фильм и особенно с такой концовкой, и что я вообще этим дерьмом хотел ей сказать. Все попытки поговорить она пресекала и отношения сошли на нет. Я был растроен и обескуражен, у меня возникло смутное ощущение, что мы с ней смотрели какие-то разные фильмы. О Наташе ходили слухи что она человек немного неординарный, но до этого ничего похожего я за ней не замечал. И только десять лет спустя я удивлением и шоком узнал, что у фильма оказывается действительно были две концовки, одна которую показывали в кинотеатрах где главный герой меняет события прошлого в детстве чтобы у её любимой женщины была устроенная жизнь, пусть и не рядом с ним, и потом случайно встречает её на улице много лет спустя, концовка в целом оптимистичная и этим мне понравилась. А вот, на VHS касетах выходила совсем другая совершенно сумасшедшая концовка в которой главный герой с помощью снимка УЗИ перемещается в себя в прошлом в утробе своей матери и пережав себе пуповину умирает. Концовка действительно странная и отталкивающая. Уж не знаю как её интерпретировала Наташа, но явно не в мою пользу. То ли она решила что я не люблю детей, то ли что просто не дружу с головой чтобы дарить своей любимой женщине такие фильмы на Новый Год.
Интересно, как сложилась её жизнь? Женщины меняют фамилии при замужестве и их потом не найти в соцсетях, но если вдруг Наташа сидит на Пикабу, мне очень жаль. Я понятия не имел, что у фильмов могут быть разные концовки и кассету разумеется не смотрел, она же была подарком. Не знаю есть ли в этой истории мораль, может быть стоит проговаривать с близкими людьми, что вам понравилось или не понравилось иногда это может быть совершенно нелепое недоразумение.
Наташа где то через год вышла замуж и наши дороги окончательно разошлись. За исключением одного эпизода, четыре года спустя когда её оставил муж с двумя детьми, она несколько своё мнение изменила, о фильмах, касетах и мне в частности. Она мне внезапно позвонила, предложила встретится и вспомнить, былые деньки, откуда то она узнала, что я получил стипендию в Японию и предложила поехать со мной. Я был ей конечно рад, но не с двумя детьми на руках, к тому же переехать означало немедленно официально оформлять отношения иначе не сделать визу, а мне это было совершенно не нужно. Так что не судьба. Изначально не хотел добавлять этот эпизод в основной пост слишком уж не романтично.
Показать полностью
Синтетическая роговица BPCDX - зрение всем и каждому, история моей борьбы с кератоконусом1
Кератоконус, фотография American Optometric Association.
Обычно с такими заголовками люди рассказывают о своей болезни и как им удалось её преодолеть, но это несколько другая история. Учёному редко удаётся повлиять на глобальные события в мире. Как правило, исследовательская деятельность заканчивается на публикации результатов в научном журнале, иногда престижном, иногда не очень. На неё ссылаются другие статьи других учёных и всё это вместе на неощутимые микрометры двигает познание человечества о мире вперёд. Эксперименты, статьи в журналах, индексы цитирования, гранты, отчёты, вот в общем то и всё. Но иногда, очень редко, одно открытие действительно меняет всё. Десятилетия люди думали о синтетической роговице. Казалось бы, роговица — это же всего лишь коллагеновая линза, в ней нет сосудов. Наши технологии разработки гидрогелей и биоматериалов значительно продвинулись за последние десятилетия. Может можно создать нечто наподобие контактной линзы, которую можно просто пришить человеку вместо больной роговицы, и он будет видеть? Собственно, именно это в конечном счёте мы и сделали, только потребовалось 10 лет, десятки тысяч, человеко-часов работы, жизни сотен крыс, кроликов и свиней чтобы получить рабочую сборку, но обо всё по порядку.
Кератоконус – это патология роговицы, где коллагеновые волокна теряют свою устойчивость, центральная часть выпячивается наподобие конуса, отсюда и название. Роговица перестаёт выполнять свои оптические свойства формируя размытое изображение на сетчатке. На начальных этапах этот процесс поддаётся коррекции очками и контактными линзами, но со временем оптических возможностей стекла становится недостаточно. Почти все системы глаза функционируют нормально, но человек больше не видит предметов и может лишь отличить день от ночи. В терминальной стадии коллапс коллагеновых волокон становится катастрофическим, роговица больше не может контролировать водный баланс, набухает и становится окончательно непрозрачной. Встречается кератоконус у одного человек из 700, этакая лотерея правда главный приз так себе. Кератоконусом страдают около 10 миллионов пациентов в мире, если собрать их в одном месте, получится город Москва или Сан-Пауло, полностью из слепых и слабовидящих людей. К сожалению, большинство пациентов с кератоконусом теряют зрение гораздо раньше, чем болезнь переходит в тяжёлую стадию, так как жёсткие контактные линзы доставляют слишком большой дискомфорт при ношении, а мягкие контактные линзы на кератоконусе не держатся из-за аномальной топографии глаза. Представьте себе дилемму, терпеть чудовищную боль в глазах, но хоть что-то видеть или смириться с жизнью в мире размытых теней. Со временем почти каждый пациент выбирает второе, слишком тяжело носить жесткие линзы.
Топография роговицы и острота зрения у здорового глаза и при кератоконусе. Красным помечается истончение роговицы в центральной зоне. Внизу симуляция астигматизма при кератоконусе.
На самом деле не так много вариантов лечения кератоконуса.
1. Крослинкинг с витамином B2 ультрафиолетовым светом – Витамин B2, он же рибофлавин очень интересное вещество, под воздействием мягкого ультрафиолета-А он может связываться с коллагеновыми волокнами увеличивая их прочность. После крослинкинга роговица укрепляется и процесс замедляется, но полностью остановить кератоконус таким образом нельзя.
2. Трансплантация роговицы – больную роговицу можно просто заменить, здоровая роговица будет иметь правильную форму и человек снова сможет видеть. Роговица наиболее успешно трансплантируемый орган. Казалось бы, почему вообще есть слепые люди с кератоконусом в таком случае? Пересадка роговицы требует развитой системы глазных банков, где процесс забора донорских глаз, тестирования гепатитов, ВИЧ и рядя других патогенов и немедленной пересадки отработан. Все это выливается в высокую стоимость процедуры и ограниченную доступность роговиц. К тому же они очень нужны для ряда других тяжёлых заболеваний как ожоги роговицы, дистрофия Фукса и многие другие заболевания требущих пересадки.
Иллюстрация процедуры кросслинкинга из материалов статьи Cross-linking of protein scaffolds for therapeutic applications: PCL nanofibers delivering riboflavin for protein cross-linking 10.1039/C3TB21789B
Виды пересадки роговицы PKP - Penetrating Keratoplasty, пересадка роговицы на всю толщину. И DALK - Deep Anterior Lamellar Keratoplasty частичная пересадка стромы роговицы с использованием лазера. Процедура DALK предпочтительней она сохраняет эндотелиальный фрагмент для ещё одной пересадки пациенту с дистрофией Фукса (если такой есть в наличии), так же процедура менее травматична, сохраняется оригинальный эндотелий и эпителий.
Синтетическая роговица должна обладать следующими свойствами.
1. Обладать высокими оптическими свойствами.
2. Не пропускать ультрафиолет, нейроны сетчатки очень его не любят, но хорошо пропускать видимый спектр.
3. Быть достаточно жёсткой для хирургического вмешательства, тончайшие полипропиленовые нити, которые используются в офтальмохирургии не должны её резать, но имплант не должен быть слишком жёстким чтобы не причинять дискомфорт и не получить отторжение. Кусок пластмассы пересадить не получится.
4. Материал должен быть совместим с клетками человеческого тела, он должен интегрироваться в живые ткани, при этом обладать достаточно жёсткой структурой, чтобы макрофаги не растащили его на сувениры.
5. По возможности синтетическая роговица должна быть сделана из дешёвого материала и подходить для массового производства и стерилизации.
6. Полученный продукт должен иметь возможность длительного хранения в том числе и при комнатной температуре.
Славный город Линкопинг.
Как видите в требованиях к материалу аналогу роговицы - сплошные противоречия. В 2015 году меня пригласили в Швецию попытаться решить эту не решаемую задачу. Деньги на это предоставляла компания LinkCare и несколько европейских грантов в том числе Европейским Arrest Blindness. Я слетал в Москву, получил Шведский вид на жительство, и полетел в славный город Ликопинг. Говорят, в Швеции довольно красиво, если честно, я страну так толком и не посмотрел, был в Стокгольме по делам несколько раз, не более того. По большей части следующие 2 года я практически не выходил из лаборатории, приспособился даже спать в офисе, да и вся наша научная команда практически жила там. Пять часов сна, кофе, таблетка кофеина чтобы разогреться с утра, сигарета или даже три и можно начинать. Как сказал классик "Распалась связь времён" день и ночь, дни, месяцы и годы слились в один размытый процесс, мир за пределами лаборатории стал казаться нереальным. Думаю мы вели не самый здоровый образ жизни.
Будни лаборатории, в кадре Мария Ксерорудаки за микроскопом, Энтони Муквая и ваш покорный слуга Доктор Ганнибал обсуждают эксперимент по очередной тестовой сборке на заднем плане.
Каждый в команде отвечал за выполнение одного или нескольких аспектов проекта. Я, в частности, тестировал сборки материала на крысах и кроликах и анализировал стабильность материала гистологическими исследованиями. Многие научные группы раньше пытались использовать разные материалы от гидрогелей, пластиков, до синтетического человеческого коллагена. Результаты в большинстве случаев получались чудовищные. Отторжение, распад материала, острый воспалительный процесс, потеря оптических свойств. Много несчастных кроликов с вытекшими глазами, очень недовольные сотрудники вивария. После нескольких неудач мы сфокусировались на коллагене тип I (Collagen I), полученном из кожи свиней, он был дешёвым, линзы из него получались с отличными оптическими свойствами. Коллаген тип 1 и не вызывал отторжения, но не все гладко было с прочностью, пропусканием ультрафиолета и долговременной стабильностью мы называли материал BPC (Bioengineered Porcine Construct). Кролики получали роговицы, они около трех месяцев они функционировали нормально, дальше иммунная система начинала разбирать пересаженный материал, коллапс трансплантата и очередная неудача. Нужно было перерабатывать дизайн, возможно использовать другой коллаген, но мы уже были близко. Тогда мы вспомнили о крослинкинге с витамином B2, если крослинкинг у людей укрепляет роговицу, может он сможет помочь укрепить и биоматериал. Так же B2 поглощает ультрафиолет, и мы сможем решить проблему пропускания ультрафиолета синтетической роговицей.
Доктор Мутукумар Тангевелу до начала проекта и после его завершения.
Мой коллега Мутукумар заработал нервное и физическое истощение, но нашёл сборку, которая отвечала нужным свойствами. Особая программа двойного ультрафиолетового крослинкинга с витамином B2 и дальнейшая стерилизация ультрафиолетом-С. В электронном микроскопе материал выглядел очень хорошо, похоже на настоящую роговицу. Главное, поместив материл в спектрофотометр, мы увидели, что поглощение ультрафиолета в целом совпадает с человеческой роговицей B2 выполнил свою задачу. Механические свойства и устойчивость на разрыв тоже вырасли. Клетки роговичного эпителия человека росли на новом материале отлично, гораздо лучше, чем обычном пластике в культуре.
а. Внешний вид биоматериала BPCDX. b. Спектрофотометрия BPCDX в УФ и видимом спектре. с. Механические свойства биоматериала, он получился в три раза менее прочным чем человеческая роговица, но этого хватило. d. снимки структуры волокон свинной роговицы и сборки BPCDX биоматериала. e. Скорость разрушения биоматериала протеолитическими ферментами в сравнении с человеческой роговицей. f. Рост клеток роговичного эпителия человека на пластике (слева) и на BPCDX (справа).
Я подсадил материал крысам подкожно, посмотреть, как будет идти заживление ран и как материал себя поведёт в живом теле. Раны у крыс заживали хорошо, а главное, когда я извлёк материал месяц спустя не было ни воспаления, ни клеточной инфильтрации вокруг импланта. Совсем чуть чуть фиброза на границе с имплантом, но материал иплантировался подкожно на не в глаза, это было ожидаемо.
Почему в данном случае тело реципиента не отторгает имплант?
Потому что очищенный коллаген 1 малоиммуногенен, имунная система на него мало реагирует, коллагены вообще очень древние протеины например у динозавров коллаген 2 такой же как страусов Первое обнаружение протеинов и ДНК динозавров
Так что коллаген 1 у свиней и людей практически идентичен. Кроме того, мы его дополнительно прошили рибофлавином, так что имунной системе ещё труднее распознать, что там вообще что-то есть. Распознать вмысле сожрать кусок считать аминокислотный код и притащить его Б клеткам, для производства антител, антитела к коллагену 1 в норме не производятся иначе они вас убьют или как минимум вызовут тяжёлое аутоимунное заболевание. К тому же кусок коллагена получился большим и монолитным не откусишь к тому же очень незаметным, на срезах из подкожной имплантации крыс видно что очень мало клеток тусутеся вокруг импланта. Ранняя версия BPC была мягкой слишком мало рибофлавина, имунная система на него не реагировала, но имунные клетки его потихоньку жрали, они так шрамы рассасывают например, шрамы то тоже из коллагена.
Теперь нужно было посмотреть, как материал поведёт себя в глазах, мы купили 10 мини свиней и принялись за работу.
Схема хирургической процедуры DALK-Flap у свиней. Фемтосекундным лазером, свиньям делался вырез роговицы в виде кармана, фрагмент роговицы удалялся и в этот карман мы помещали биоматериал. В качестве контроля мы использовали вырезанные фрагменты оригинальной роговицы и подсаживали их обратно, это называется аутотрансплантация.
Свиньи пожалуй лучшее животное для экспериментов на глазах, но большое, дорогое и шумное.
Дальше было очень много возни со свиньями они ведь только мини по сравнению с обычными, 30 килограммовые зверюги которым нужно было капать дексаметазоновые капли в глаза после операции, под дикие визги в экспериментальном хлеву.
а. Результаты оптической когерентной томографии и фотографии глаз 6 месяцев после пересадки. b. Пахиметрия (топография) роговицы после пересадки роговицы или материала BPCDX. c. Параметры тощины роговицы и частота осложенений после пересадки у мини-свиней. d. Конфокальная микроскопия слоев роговицы с автографтом или BPCDX.
Полгода спустя эксперимент подошёл к концу, к нашему восторгу биоматериал, который мы к тому времени назвали BPCDX (bioengineered porcine construct, double crosslinked) полностью интегрировался, даже лучше, чем при авто-трансплантате, родной кусок роговицы, который мы вырезали и сразу пересадили обратно для контрольной группы. Топография роговицы выровнялась, а самое главное вкруг биоматериала стали расти роговичные нервы и никакого воспаления или помутнения.
Интеграция биоматериала в окружающие ткани роговицы по результатам гематоксилин эозинового окрашивания. Бета-3-Тюбулин показывает рост нервов вокруг импланта.
Настало, временя испытать процедуру и биоматериал на слепых людях с кератоконусом. Это был очень длительный с точки официальных документов и очень напряжённый этап. Если мы где-то допустили ошибку, например, в том, что свиной коллаген хорошо приживался у свиней, но у людей может вызывать иммунный ответ, а протестировать снова уже не было времени и денег. Если я ошибся, десятки людей испытают чудовищные страдания и возможно потеряют то немногое, что них осталось от их глаз. Уверен ли я в своих результатах? Когда я подписывал документ “Свойства биосовместимости допустимы для человеческого применения”, я на самом деле вовсе не испытывал той уверенности, что показывал комиссии во время презентации.
Тестировать биоматериал мы решили на группе добровольцев из Ирана и Индии. Во-первых, из финансовых соображений, это было дешевле ресурсы выделенные на проект стали подходить к концу, во-вторых, в этих двух странах было достаточно полностью слепых пациентов с кератоконусом, и хирурги в двух центрах согласились участвовать в проекте. Мы немного беспокоились, что пациенты в Иране могут отказаться от трансплантации по религиозным соображениям, всё-таки биоматериал был сделан из свиного коллагена, но, проблем с этим не возникло, никто даже не задал о свином коллагене вопрос, наверное, когда ты едва можешь отличить день от ночи границы допустимого, сильно раздвигаются.
Внешний вид тестового продукта для клинических испытаний. Тестовая сборка BPCDX до начала массового производтсва. Кроме собственно кератоконуса BPCDX может быть использован как замена человеческой роговицы при множестве других патологий требующих пересадки.
Основные критерии для отбора для участия в клинических испытаний были следующие:
-Возраст совершеннолетия.
-Выраженный кератоконус
-Показания к пересадке роговицы.
-Способность понять объяснения и подписать официальные документы для участия.
-Отсутствие операций на глаза
-Отсутствие системных заболеваний
Операции прошли штатно, они сравнительно простые и мы давно всё отработали на свиньях. С каждой неделей я с ужасом ждал звонка или электронного письма, что импланты начали отторгаться. Мне снились выворачивающие душу кошмары в котором я был окружён людьми с вытекшими глазами они цепко хватали меня за руки и кричали на непонятном языке, но я понимал - "Это ты виноват!", с кофеином в таблетках нужно было завязывать. Но эти переживания были у меня в голове, в реальности, сразу после операции люди смогли видеть. Пусть им всё равно потребовались очки или контактные линзы, но они по крайней мере могли их теперь носить. В больницу привели 20 практически слепых людей, вышли уже зрячие пусть и на один глаз. Из соображений безопасности пациентов мы делали трансплантацию только на одном глазу. К 6 месяцам я наконец выдохнул, похоже трансплантаты были стабильны, оставалось только ждать. Дольше 6 месяцев мы на животных эксперименты не проводили и меня несколько беспокоил тот факт, что мы не знали как долго рибофлавин который держал коллагеновые волокна остаётся стабильным тем более в человеческом теле, проект шёл через неизведанные воды. Узнать, что происходит с пациентами больше не представлялось возможным, повторный осмотр была запланирован только через 1.5 года, так что отсутствие новостей было само по себе хорошей новостью.
Схема операции при испытании BPCDX у людей.
К концу первого года после пересадки я стал забывать о пациентах и проекте в целом сместив свои интересы в сторону нейробиологии, дегенерации сетчатки и болезни Альцгеймера. Наконец 24 месяца после пересадки пациенты вернулись в клинику, пришли своим ходом и без сопровождающих, большинство пациентов жили полноценной жизнью, смогли найти работу, многие просили нас провести пересадку на второй глаз, к сожалению, программа исследования этого не подразумевала и бюжет проекта был истощён. Результаты были отличными, BPCDX интегрировался в окружающие такни, роговичные нервы регенерировали эпителий и эндотелий роговицы функционировали штатно, а главное никакой резорбции и отторжения импланта.
Пахиметрия и оптическая когерентная томография у пациентов в Иране до и после хирургического вмешательства. В нижнем левом углу фотографии BPCDX в глазах у двух пациентов 6 месяцев после хирургического вмешательства. В нижнем правом углу результаты конфокальной микроскопии роговичных нервов и эндотелия после пересадки BPCDX.
Показатели у 12 пациентов с кератоконусом в Иране, до и после операции, обратите внимание на число полностью слепых, до операции 6 и после операции 0. А так же появившуюся строку зрение LogMAR lines gained.
а. Фотографии щелевой лампы, до и после операции. b. Оптическая когерентная томография роговицы до и после операции, довольно хорошо видно имплантированный биоматериал BPCDX в Индии была хороший OCT инструмент. c. Результаты топографии роговицы, хорошо видно улучшение толщины и более равномерная поверхность особенно в центральном регионе.
Результаты у пациентов в индии, все 8 пациентов были полносью слепы на момент операции. И все вернули и сохранили зрение 2 года спустя. Как видите результаты из группы в Индии немного лучше чем в Иране. Одним из возможнных факторов чуть меньшая толщина BPCDX транспланта.
С тех пор как я ушёл из хирургии в науку, мне очень редко удаётся увидеть практические результаты своей работы, но это было особенное ощущение, все эти люди, мужчины и женщины уже второй год могут видеть благодаря нашей работе, это было очень необычное удивительное чувство. В ближайшие несколько лет, когда будут получены разрешающие документы биоматериал будет одобрен для массового клинического применения кератоконус больше не будет забирать у людей возможность видеть этот мир.
Слева направо: Энтони Муквая, Мария Ксерудаки, Доктор Ганнибал, Мирабелли Перфранческо, Нил Лагалли.
Ещё около года мы писали научную статью обрабатывали результаты и перепроверяли статистику, дальше статья ушла в Nature Biotechnology журнал с impact factor 68. Ревизии и проверка данных продолжалась ещё полтора года, журнал проверял и перепроверял каждый эксперимент и каждый результат. Наконец, 11 Августа 2022 года статью опубликовали.
Публикация Rafat, M., Jabbarvand, M., Sharma, N. et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol (2022).
Received: 28 April 2021, Accepted 29 June 2022; Published11 August 2022
DOI https://doi.org/10.1038/s41587-022-01408-w
Про нас довольно много пишут в новостях https://www.nature.com/articles/s41587-022-01408-w/metrics
Подводя итог, BPCDX сейчас проходит одобрение для массового применения в Евросоюзе и США уверен остальные страны поддтянутся за лицензиями на покупку и производство, надеюсь Россия не останется в стороне. Кератоконус перестал быть заболеванием угрожающим зрению. Следующие пять лет мы ождаем сотни тысяч имплантаций по всему миру. Комманда Нила Лагали vs Кератоконус 1:0.
Показать полностью
19
Можно ли генномодифицировать собственные клетки?
Для ЛЛ: Можно!
Внимание: Не рекомендуется повторять описанные в статье действия.
Стрелки указывают на колонии трансдуцированных (заражённым врусом) клеток в моём теле.
Я создал этот пост как демонстрацию, насколько на самом деле просто и сравнительно безопасно можно синтезировать вирусные векторы и внедрять синтетические гены в человеческие клетки. Примерно похожим способом создавалась вектораня вакцина Спутник-5. Вектор это синтетическая ДНК, которая соддержит ряд генов которая система лентиврусной доставки встроит в код ДНК целевой клетки.
В данном случае мы используем вектор pLenti-EF1a-C-mGFP-P2A-Puro из интересных генов на векторе mGFP синтетически зелёный флоуресцентный протеин основанный на сиквенсе оригинального GFP из генома медузы Aequorea Victoria обеспечивает яркую флоуресценцию в синем (488 нм) свете. Длинная гена GFP 720 нуклеотидных последовательностей общий размер вектора 8300 нуклеотидов.
Так же на векторе есть ген устойчивость к пиромицину (клетки соддержащие этот ген не погибнут при воздействии пиромицина) всё это под промотером EF1a который обеспечивает постоянное производство mGFP и остальных генов. Вот карта вектора в подробностях. Обратите внимания на участкок помеченный SgfI Asc I и Rsr II, MluI и Not I по сути этот вектор заготовка, если в этот участок врезать (с помощью ферментов рестриктаз) код того или иного протеина трансдуцированные клетки будут его производить а GFP всего лишь маркер доставки. Если клетки светятся зелёным значит трансдукция произошла успешно. Если бы я вставил в вектор сиквенс S-протеина COVID-19 у меня бы получилась вакцина к COVID-19 собственного производства. Таким же образом можно лечить заболевания когда утрачена та или иная функция генов.
Медуза Aequorea Victoria свечение медузы обеспечивает Аквеорин который продуцирует синее свечение в присутствии ионов калция. GFP поглощает этот свет и излучает уже зелёное свечение. Аквеорин используется в исследовательской работе для оценки количестве калция в клетках. За расшифровку генетической последовательности GFP 2008 году Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсьен получили Нобелевскую премию по химии «за открытие и разработку зелёного флуоресцентного белка GFP».
Всё это упаковывается в лентивирусную оболочку с помощью двух дополнительных плазмид PAX2 и VSV-G фомируя вирусные частицы и собирается воедино на клетках HEK293T это наш инкубатор для сборки вируса. Клетки HEK293 широко используются для производства вирусов и протеинов. Противники вакцин часто упоминают HEK293 как материал нерождённого мальчика. Да, действительно HEK293 были получены из абортивного материала, можете подробнее про них почитать тут: https://ru.wikipedia.org/wiki/HEK_293
Клетки HEK293T 80% конфлюентности, готовый материал для сборки вируса.
После того как HEK293T произвели вирус, достаточно его отфильтровать из кульутры, используя 0.22 мкм фильтр он остеет клетки и клеточные фрагменты. У меня получилось что-то в духе 3 миллиардов вирусных частиц на миллитр объема. Теперь давайте посмотрим как оно работает. Помните любая заражённая клетка будет светится в синем свете. Можно было конечно заразить клеточную культуру и посмотреть на неё под микроскопом. Как видите, эффективность трансдукции около 30% тут как раз может пригодится ген устойчивости к пиромицину если добавить пиромицин в культуру не трансдуцированные клетки погибнут и получится чистая культура трансдуцированных клеток, этот процесс называется селекция.
Но заражать клеточные культуры это настолько банально, что я решил заразить вирусом самого себя и просто набил 23G иглой слово Pikabu у себя на запястье, обмакивая иглу в ампулу с вирусом. Очень приблизительно каждый укол доставлял 3-5 миллионов вирусных частиц. Это совсем не опасно, на самом деле что-то такое (заражение клеток вашей кожи различными вирусами) происходит ежедневно вы просто этого не замечаете. Разумеется не было ни температуры ни каких либо симптомов. Хорошо, что я как следует отфильтровал и для надёжности заморозил и разморозил вирусную культуру, идея ввести себе хотя бы несколько жизнеспособных HEK293T клеток более чем пугающая, теоретически моя имунная система может с ними справится, но это очень агрессивные и быстростущие онкологические клетки, у меня нет ни малейшего желения это проверять.
Спустя несколько дней, я решил посмотреть получилась ли у меня генно-модифицировать свои клетки. Тут я столкнулся с рядом проблем. Моё оборудование расчитанно на микроскопические объекты, но как при этом подсветить собственную руку светом 488 нм и при этом сделать фотографию? Решение было следующим, источником света был всё тот же микроскоп для экситации GFP светом 488 нм, но если просто сделать фотографию таким образом, ничего не будет видно из за отражения синего света в камеру телефона. Поэтому я добавил фильтр перед камерой телефона который блокировал значительную часть синего света, фильтр далеко не идеальный и несколько сбил цветовую гамму. Качество снимка получилось так себе, но видите эти яркие точки, это как раз свечение GFP в местах уколов где сформировались колонии заражённых лентивирусом клеток! Теперь у меня на руке есть скрытое слово Pikabu которое можно увидеть только в ярком синем свете за счёт внедрения генов медузы. Оставаться оно там будет достаточно долго, однако глобального позеленения можно не опасаться, лентивирус не имеет кода репликации, так что размер светящихся точек примено соотвествует количеству вирусных частиц доставленных в уколе иголкой. Разумеется можно добиться ещё более яркого свечения, если сделать иньекцию значительно большего количества лентивирусных частиц. Если бы авторы вакцины Спутник 5 решили прикрутить GFP к вакцине, то в месте укола бы появилось яркое пятно которое бы светилось в синем свете.
Подводя некий итог, лентивирусы работают в человеческом организме так же эффективно как и в клеточной культуре. Их производство вполне отработанный и не сложный процесс, если имеются хотя бы базовые инструменты и знания моллекулярной биологии. Однако даже если у вас есть необходимые условия для производства аденовируса или лентивируса не стоит повторять этот эксперимент, нужно очень хорошо понимать, что и как вы делаете. Надеюсь теперь вы лучше понимаете принципы создания и применения вирусных векторов в медицине для создания вакцин и лечения генетических заболеваний.
Показать полностью
6
Можно ли вставлять обратно выбитые зубы и как это правильно делать?1
В соавторстве с @IvaMouse
Без жести: Пост не соддержит фотографий травм зубов и ротовой полости, только схематические иллюстрации.
Многие из нас особенно в детстве просто вставляли выбитый коренной зуб обратно, чтобы не ругались родители и в некоторых случаях зуб полностью восстанавливался или по крайней мере служил ещё несколько лет, прежде чем приходилось обращаться к стоматологу. Недавнее обсуждение о выбитых зубах и рассказах в комментариях об успешной реимплантации навело меня на мысль написать этот пост. В России реимплантация собственных выбитых зубов широко не известна, в то же время в США стоматологи прямо рекомендуют попытаться сохранить выбитый зуб с целью реимплантации.
Обратите внимание: Доктор Лектер не является профессиональным стоматологом, эта информация носит сугубо ознакомительный характер и не является рекомендацией для проведения каких-либо лечебных мероприятий. Вы несёте полную ответственность за любые последствия применения или не применения действий, описанных в данной статье.
Для ЛЛ: Да, в некоторых случаях можно вставить обратно выбитый зуб, однако только как временную меру и всегда необходимо обращаться в таких случаях к стоматологу.
Иллюстрация перевод материалов статьи: Skaare AB, Jacobsen I. Dental injuries in Norwegians aged 7–18 years. Dent Traumatol 2003;19:67–71. Данные в процентах указаны для популяции 1275 подростков обоего пола в Норвегии. В России эти цифры могут отличаться.
Наиболее часто встречаются сотрясения и подвывих без смещения 48.7%, а так же не осложнённые сколы эмали и дентина 35.6%. Эти травмы как правило не вызывают пульпита (воспаления нервов и сосудистого пучка зуба) и не требуют немедленного обращения к стоматологу, хотя это всё равно крайне желательно так как оценить серьёзность травмы зуба без рентгена сложно, например перелом корня. Пульпит всегда требует стоматологической помощи, вскрытия зуба, удаления пульпы и пломбирования корней. Болевой синдром при не леченном пульпите может быть крайне выражен и плохо купироваться обезболивающими кроме наркотических. Все остальные травмы встречаются достаточно редко не более 2-3% от всего многообразия повреждений зубов. Как видите авульсия, (травматическое удаление целого зуба с корнем), встречается ещё реже всего 0.6% случаев травм зубов.
Этот интересный график построенный на той же популяциии Skaare AB, Jacobsen I. Dental injuries in Norwegians aged 7–18 years. Dent Traumatol 2003;19:67–71. указывает на наибольшую частоту травм зубов в период 8-10 лет. После чего частота травматизации падает с незначительным подьёмом к возрасту совершеннолетия.
Авульсия – это полный травматический вывих зуба с корнем, как правило в результате падения или ударов по лицу. На поверхности корня свежевыбитого зуба имеются жизнеспособные клетки – цементобласты. От них зависит приживление зуба в лунке, поэтому очень важно сохранить их. Как? Об этом ниже. Клетки пульпы (ткани, что находится внутри зуба), при такой травме погибают довольно быстро. Поэтому стоматолог на приеме не только профессионально зашинирует зуб, но и призведет удаление содержимого корневого канала и запломбирует его. Исключения возможны только у детей, если верхушка корня зуба не до конца сформирована.
Клеточная культура остеобластов дифференцированная из клеток стволового мозга. Окрашивание клеточного скелета фаллоидином (фиолетовый), альфа-тюбулином (зелёный), ядра окрашенны DAPI (жёлтый). Цвета условные. Автор: Kevin Mackenzie, University of Aberdeen
Люксация зуба - наилучший вариант если при вывихе связки сохраняется соединение корня с десной. Такой зуб ни в коем случае не нужно выдёргивать, а аккуратно вправить в лунку, обеспечить страдальцу полный покой и как можно скорее обратиться к стоматологу, чтобы оценить степень повреждения корня и зашинировать зуб. При люксации есть шанс, что пульпит не разовьётся и зуб может полностью восстановиться.
Если зуб выбит и находится во рту или на земле?
Ваши действия в данном случае зависят от того, как быстро вы сможете обратиться к стоматологу. Если в течение нескольких часов, то выбитый зуб необходимо поместить в рот. Слюна и температура вашего тела обеспечит выживание клеток зуба и посодействует реимплантации. Постарайтесь зуб не проглотить и им не подавиться. Разумеется нельзя спать с выбитым зубом во рту. При манипуляциях с выбитым зубом держите зуб за коронку, а не за корень, его старайтесь не трогать. Если зуб не ваш, то постарайтесь воспользоваться перчатками если их нет, не трогать зуб руками. Не следует мыть зуб водой с мылом, а особенно алкоголем - это убьёт цементобласты и затруднит или сделает невозможной реимплантацию. Молоко также является хорошей питательной средой для сохранения зуба жизнеспособным по крайней мере в течение 1-2 часов. Можно так же использовать физраствор (раствор для линз). В США где действия по реимплантации выбитых зубов активно рекомендуются стоматологами, можно приобрести специальную аптечку контейнер Save a tooth, которая соддержит физраствор Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
Можно ли вставить зуб обратно самостоятельно?
Если стоматолог в ближайшие дни никак не предвидится, и имеет место авульсия (зуб выбит целиком с корнем и не обломан) можно попытаться сделать реимплантацию самому. Обратите внимание, самостоятельная реимплантация — это мера отчаянья, попытка сохранить зуб до момента, когда посещение стоматолога станет возможно, однако она связна с серьёзным риском. Главное условие для успеха самостоятельной реимплантации выполнить её как можно быстрее (желательно в первые 5-10 минут после травмы) и чистая лунка зуба. Грязь, осколки кости или надкостницы гарантируют отторжение зуба и серьёзное воспаление. Если в лунке зуба много осколков возможно не стоит и пытаться провести реимплантацию, а сфокусироваться на поиске профессиональной стоматологической помощи, но если вы непреклонны и готовы идти на риск и терпеть боль, то вооружившись пинцетом фонариком и зеркалом можно попытаться лунку очистить. Вставьте выбитый зуб, затем закусите бинт или салфетку чтобы давлением завершить реимплантацию и держите давление 30-40 минут. Лучше это делать первый час пока лунка не отекла. Полностью исключите нагрузку на зуб в течение 48-36 часов никакой еды. Только питье желательно без сахара. Можно добавить антибиотик широкого спектра например амоксициллин если он есть под рукой и у вас нет противопоказаний к его использованию.
Почему в России стоматологи не рассказывают о возможности реимплантации?
Потому, что авульсия целого зуба при травмах встречается сравинительно редко. Реимплантация связанна с серьёзным риском осложнений. Стоматологическая помощь в России в первую очередь установка дентальных имплантов более финансово доступна населению, чем в Северной Америке. Тем не менее, реимплантация заслуживает внимания, особенно у детей. Потеря переднего зуба не радует никого, но для подростка может стать особенно болезненной. И если взрослому будет предложена имплантация, то ребенку до 18 лет она не показана (мальчикам, в идеале, делают еще позже). До этого возраста ребенку придется пользоваться частичным съемным протезом.
Иллюстрация из статьи Skaare AB, Jacobsen I. Dental injuries in Norwegians aged 7–18 years. Dent Traumatol 2003;19:67–71. Показывает процентное соотношения повреждений передних зубов у детей в возрасте от 7-18 лет. При травмах в 68% страдают верхние передние зубы.
В каких случаях реимплантация невозможна?
Если корень зуба при травме сломался. Если зуб молочный. Если «при жизни» зуб был не совсем здоров (разрушен обширным кариесом), если окружающие зуб ткани были поражены воспалительным процессом. Если с момента травмы прошло слишком много времени либо зуб «транспортировали» в ненадлежащих условиях или допутили его высыхание.
Если выбито несколько соседних зубов можно ли их всех вставить?
Только с помощью стоматолога. Самостоятельная реимплантация нескольких выбитых зубов не рекомендуется, без шинирования они не будут держаться.
Можно ли выполнить шинирование зуба(ов) самостоятельно?
Нет!
Какие могут быть осложнения от процедуры самостоятельной реимплантации?
Самое главное — это инфекция кости и надкостницы, именно поэтому вашу самодеятельность необходимо как можно скорее показать стоматологу. Так же зуб может быть установлен неправильно, например были случаи, когда при самостоятельной реимплантации зубы приживались под углом или вообще задом наперёд. Несмотря на успешную реимплатацию зуб при этом подвергается не корректной нагрузке и достаточно быстро разрушается.
Я вставил зуб обратно, но несколько дней спустя он по-прежнему болит, что делать?
К этому времени вы уже должны были обраться к стоматологу. Если боль со временем усиливается, и вы чувствуете воспаление в имплантированном зубе и окружающих тканях значит реимплантация была не успешной ткани зуба погибли и развилась инфекция. Опять же если стоматолог вам никак не доступен и со временем воспалением усиливается реимплантированный зуб необходимо удалить, чтобы обеспечить отток гнойного содержимого и спасти вас от генерализованной инфекции челюсти.
Можно ли реимплантировать обломок зуба?
Если речь идёт о сколах эмали дентина, нет нельзя. Такой обломок (если он крупный) можно попробовать принести к стоматологу. Но скорее всего скол будет восстанавливаться композитным материалом, а не отломленным фрагментом. Сколы дентина и эмали соддержат достаточно мало живых клеток, такой обломок без профессионального шинирования не будет держаться.
Можно ли реимплантировать выбитые молочные зубы?
Нет, нельзя. Реимплантацию выбитого молочного зуба даже при успехе может нарушить рост постоянных зубов. При авульсии молочного зуба, нужно найти зуб чтобы ребёнок им не подавился и в ближайшие дни показать ребёнка стоматологу, чтобы убедиться, авульсия не повредила постоянный зуб под молочным и что нет повреждений других зубов при травме.
Можно ли вставить себе зуб(ы) другого человека?
Нет, нельзя. Причин много, но главные это несовпадение формы зуба и лунки, а также отторжение чужеродного зуба. Теоретически зубы близнецов совместимы межу собой, но на практике или научной литературе такие случаи не описаны.
Можно ли вставить себе зуб(ы) животного?
Просто - нет. Есть люди, которые проделывали нечто подобное, в сочетании с другими модификациями своего тела (экстремальным пирсингом, татуажем и т. д.) но только в виде медицинских имплантов только внешне напоминающих зубы животных или изготовленные в виде слепков с них и доработанных по прикусу.
Надеюсь вы узнали для себя что-то новое о травмах зубов и что на практике Вам эта информация никогда не пригодится.
Показать полностью
7