Редактирование генома, в том числе высокоорганизованных организмов, – давно уже не новость. Однако пока такая корректировка «неправильных» генов у человека в основном сводится к редактированию клеток, выделенных из крови пациента, которые после обработки «в пробирке» вводят обратно. Но подобное вмешательство в геном требуется и для клеток «плотных» органов, к тому же в значительном объеме. Примером может служить печень, в клетках которой нужно «исправить» ген, кодирующий определенный фермент. Но такая работа «по живому» (in vivo) далеко не безопасна, поэтому ученые пытаются оптимизировать методики, проверяя разные варианты на близких к человеку организмах, таких как приматы
Несколько лет назад в редактировании наследственной информации произошел революционный прорыв, когда на основе механизмов бактериального «иммунитета» был разработан простой и точный метод генетической инженерии CRISPR/Cas. Число работ в этой области резко возросло, а их результаты уже не звучат как научная фантастика. Не забывают и более «старые» методы редактирования генома, такие как «цинковые пальцы» и др.
Сегодня с помощью CRISPR/Cas создают генномодифицированных обезьян, использующихся в качестве моделей человеческих болезней, и проводят эксперименты, хотя и ограниченные, на эмбрионах человека. Уже в клинических испытаниях на ВИЧ-инфицированных больных с помощью метода «цинковых пальцев» в Т-лимфоцитах был «отключен» ген, что обеспечивает человеку невосприимчивость к ВИЧ. Были сделаны и попытки редактировать геном человека in vivo, например, в клетках печени больного синдромом Хантера, у которого из-за дефицита одного печеночного фермента в организме накапливаются мукополисахариды.
Ученые из Пенсильванского университета (США) выбрали в качестве мишени ген, кодирующий печеночный фермент PCSK9, играющий важную роль в обмене холестерина. Этот белок снижает способность печени выводить из организма липопротеины низкой плотности, уровень которых прямо связан с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. Имеющиеся на сегодня препараты, ингибирующие этот белок и способствующие снижению уровня «плохого холестерина», дороги, да к тому же помогают не всем.
Процесс редактирования генома можно подразделить на два этапа. Во-первых, нужно создать соответствующую молекулярную конструкцию, а затем каким-то образом доставить точно в нужные клетки. Для доставки исследователи использовали так называемый вирусный вектор на основе безопасного аденоассоциированного вируса, которому «добавили» компоненты, нужные для внутриклеточного синтеза. Сначала ученые использовали системы CRISPR в качестве инструмента «выключения» гена, кодирующего белок PCSK9. На лабораторных мышах эксперимент прошел удачно, однако эти результаты не удалось воспроизвести на главных подопытных – макаках-резусах. Поэтому для приматов применили более старый инструмент редактирования генов – на основе мегануклеаз.
Мегануклеазы – это искусственные аналоги природных ферментов, разрезающих цепочку нуклеиновой кислоты, которые имеются у ряда низкоорганизованных организмов, таких как бактерии, фаги, водоросли и др. Эти ферменты распознают целевой участок ДНК по очень длинному фрагменту (10–40 пар нуклеотидов), что делает маловероятным присоединение мегануклеазы в «неположенном» месте.
Ученые создали такую мегануклеазу на основе модифицированного фермента хламидомонады, одноклеточной зеленой водоросли, «обучив» его распознавать и разрезать участок, соответствующий гену PCSK9. Этот разрыв в цепи ДНК восстанавливается клеточными системами репарации, однако при этом обычная последовательность нуклеотидов нарушается, и активный белок PCSK9 не синтезируется. Для нацеливания мегануклеазы выбрали такую нуклеотидную последовательность в гене PCSK9, которая одинакова у обезьян и человека.
Это была победа: уже через 4 месяца после введения макакам генно-инженерного конструкта уровень белка PCSK9 в их крови упал на 28–84%, в зависимости от дозы агента, а уровень липопротеинов низкой плотности понизился вдвое и более. И этот уровень оставался стабильным в течение года после эксперимента!
Опасно ли такое «редактирование» для организма? В первые дни эксперимента действительно был отмечен рост активности печеночных ферментов трансаминаз, что отражает неблагополучие этого органа. По-видимому, это было следствием иммунного ответа на введение в организм чужеродного белка. Тем не менее животные чувствовали себя при этом хорошо, а уровень трансаминаз постепенно пришел в норму.
Однако в «бочке меда» оказалась и капля «дегтя»: несмотря на специфичность действия мегануклеазы, в некоторых случаях было отмечено нарушение структуры ДНК в нецелевой области, что само по себе несет потенциальную опасность. В поддержку нового метода терапии служит тот факт, что активность введенной векторной конструкции достигала максимума на 17–18 день эксперимента, а затем снижалась до полного прекращения.
Ученые считают, что несмотря на имеющиеся недочеты, вполне реально довести новую терапевтическую методику до практического использования. С ее помощью можно было бы лечить больных сердечно-сосудистыми заболеваниями с высоким уровнем «плохих» липопротеинов, которым не помогают современные ингибиторы PCSK9. Исследователи уже опробовали новый метод на человеческих клетках, правда, пока только «в пробирке», вырастив клетки печени из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Фото: https://www.flickr.com и https://www.flickr.com
