Crispr

Российские ученые из шести крупных научных организаций совместно разработали новую стратегию получения клеточных нокаутов, которая избавляет от долгой и кропотливой процедуры выращивания и скрининга клонов в целях поиска желаемой мутации. С результатами исследования можно ознакомиться в статье журнала Scientific Reports.

Настоящую революцию в генной инженерии произвело открытие системы CRISPR/Cas9. CRISPR – это короткие повторяющиеся участки в ДНК (дословно «сгруппированные короткие палиндромные повторы»), которые вместе с белками Cas (дословно «белки, связанные с CRISPR») представляют собой своеобразный аналог иммунитета у бактерий, они помогают микроорганизмам защищаться от вирусов. CRISPR хранят в себе информацию о вирусах, ранее атаковавших бактерии, а Cas разрезают вирусную ДНК для дальнейшего уничтожения. С 2013 года мировое научное сообщество начало применять эту систему для редактирования генов не только бактерий, но и высших организмов (активно проводятся первые эксперименты на клетках человека), что открывает новые возможности для лечения всевозможных болезней человека, включая тяжелейшие вирусные, онкологические и наследственные (например, ВИЧ, синдром Дауна и др.)

«Разработанный нами новый метод отбора редактированных клеток заключается в том, что клетки с искомой генной модификацией экспонируют на своей поверхности короткий пептид. С помощью антитела к данному пептиду и, используя метод клеточной сортировки, можно легко и быстро выделить желаемые клетки-нокауты по любым генам, в том числе продукты которых находятся внутри клетки или секретируются во внешнюю среду. Генетическая конструкция, которую мы разработали, и которая позволяет пептиду транспортироваться на поверхность клетки и одновременно выключать ген, является самой короткой, но в тоже время эффективной среди существующих в настоящее время маркеров селекции. Мы назвали наш метод SORTS (surface oligopeptide knock-infor rapid target selection), аббревиатура которого в переводе близка к слову «сортировка» и отражает суть нового метода. SORTS оказался полезным не только для необратимой инактивации гена, но и для регулируемого с помощью так называемого дегрона выключения гена на уровне белка, что позволяет изучать функцию жизненно важных генов», — комментирует руководитель группы клеточных и генных технологий Института биологии гена РАН Дмитрий Мазуров.

Метод обеспечивает быстрый и эффективный отбор полученных нокаутов без длительного и трудоемкого метода клонирования клеток, что позволяет быстро и надежно получить три линии генетически отредактированных клеток эмбриональных почек человека, нокаутных по содержанию митохондриальных поринов. Применение этого метода, по утверждению авторов, «подходит для любых генов, а также может иметь дополнительные преимущества по сравнению с уже имеющимися методами молекулярной биологии». На примере клеточных культур человека, зараженных ВИЧ, авторский коллектив уже продемонстрировал возможность уничтожения данного вируса, ДНК которого стабильно встраивается в геном человека и не может быть удалена современными средствами лечения. Работа в этом направлении продолжается.

Источник: https://indicator.ru/news/2019/04/13/bystrogo-otbora-kletok-...

Схема высвобождения Cas9 в клетках путем фотоактивации на ап-конверсионных наночастицах.

Китайские ученые разработали средство доставки системы редактирования генома, которое позволяет включить ее в организме животного только в нужном месте при помощи инфракрасного излучения. Для этого белок Cas9, заряженный направляющей РНК, пришили к ап-конверсионным наночастицам при помощи фоточувствительного линкера. Как докладывают авторы статьи в Science Advances, при помощи таких наночастиц, заряженных против одного из онкогенов, им удалось притормозить рост опухоли у мышей.

Системы редактирования генома, в частности, CRISPR-Cas9, позволяют уже во взрослом организме направленно изменить экспрессию гена только в конкретном органе или опухоли, однако для безопасного использования желательно ограничить их активность не только в пространстве, но и во времени. Для этого ученые разрабатывают системы, которые по умолчанию неактивны, но их можно включить направленным физическим воздействием. К примеру, мы рассказывали про намагниченные вирусные наночастицы с CRISPR-Cas9, которые проникают в клетки только под действием магнита.

Еще один удобный способ запустить процесс в отдельном органе — ближнее инфракрасное излучение, которое хорошо проникает через ткани. Именно этот способ выбрали исследователи из Университета Нанкина (Китай), чтобы высвобождать комплексы Cas9 c РНК внутри опухоли в нужное время. В качестве средства доставки системы редактирования ученые выбрали ап-конверсионные наночастицы, допированные лантаноидами, которые превращают инфракрасное излучение в ультрафиолет и видимый свет (подробнее мы рассказывали про применение таких частиц в оптогенетике здесь). К наночастицам пришили Cas9 при помощи фоторасщепляемого линкера (гидроксиметил-нитробензойной кислоты). После попадания в клетки и воздействия инфракрасного излучения частицы превращают его в ультрафиолет, который расщепляет линкер и высвобождает Cas9. Комплекс Cas9-РНК уже попадает в ядро и вносит мутацию в нужный ген.

Для эксперимента на мышах авторы работы зарядили Cas9 направляющей РНК против гена PLK-1, повышенная экспрессия которого ассоциирована со многими типами рака, и подавление которого в опухолевых клетках вызывает апоптоз. Выяснилось, что при внутривенной доставке наночастиц они в основном аккумулируются в печени и селезенке, поэтому наиболее эффективно колоть их прямо в опухоль. Мышам с привитой опухолью из клеток человеческой аденокарциномы легкого делали инъекцию наночастиц, а затем в течение 20 дней воздействовали на опухоль ближним инфракрасным излучением. В результате опухоль не исчезла совсем, но ее рост у мышей из опытной группы заметно затормозился.

Размеры опухолей у мышей из контрольных групп (верхний и средний ряд) и из опытной группы, которой вводили наночастицы с Cas9-РНК и после этого нагревали опухоль (нижний ряд)

Авторы, тем не менее, признали, что опухоли, в которые можно сделать инъекцию, обычно можно удалить при помощи операции, поэтому теперь перед ними стоит задача модифицировать частицы так, чтобы они могли доставлять Cas в нужное место при системном введении.

Мы также рассказывали, как ученые пришили комплексы с Cas9 к золотым наночастицам, и с их помощью смогли управлять экспрессией генов в мозге взрослых животных.

Источник: https://nplus1.ru/news/2019/04/03/UCNP-CRISPR

Китайский ученый Цзянькуй Хэ, который в ноябре заявил о рождении первых в мире CRISPR-детей, близняшек Лулу и Наны, помимо устойчивости к заражению ВИЧ, скорее всего, внес изменения и в работу их мозга, так как ген CCR5, который он редактировал, связывают с памятью, когнитивными способностями и даже восстановлением после инсульта. На это указал генетик Альсино Силва, который считает, что пока не ясно, как именно редактирование повлияет на работу мозга детей, сообщает MIT Technology Review.

Цзянькуй Хэ ранее заявил, что в ноябре родились близняшки, у которых он попытался создать устойчивость к заражению ВИЧ. Хэ рассказал о своей работе в интервью Associated Press, опубликованной научной статьи о его исследовании или независимых подтверждений пока нет. Китайские власти в январе сообщили о предварительных итогах расследования работы Хэ, подтвердив не только существование близняшек Лулу и Наны, но и еще одну беременность участницы эксперимента. Ученый, по заключению властей, действовал самостоятельно, не информируя никого о своей работе, и грубо нарушил этические нормы и законодательство страны. В последний раз Хэ видели в декабре 2018 года в университетской гостинице под охраной людей в штатском из неизвестного ведомства.

Как отмечает MIT Technology Review, с 2016 года ген CCR5 связывают с когнитивными способностями: его удаление улучшало память у мышей. Этими исследованиями занимается группа Альсино Силвы (Alcino Silva) из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Ученые сообщили журналу, что Хэ не связывался с ними, однако на саммите в Гонконге, где он рассказывал о своих результатах, ученому задали вопрос о работе группы Силвы с геном CCR5, и Хэ ответил, что знаком с этой работой, считает, что она нуждается в независимой проверке и не поддерживает генетическое редактирование в целях создания более совершенных людей.

Силва заявил изданию, что «скорее всего, [генетическое редактирование] повлияло на мозг детей», однако как именно, сказать невозможно, «и именно поэтому никто не должен заниматься этим». Он отметил, что как только узнал о CRISPR-детях, сразу заподозрил, что на самом деле это была попытка редактирования генома не для защиты от ВИЧ, а для усиления когнитивных способностей, и это крайне расстроило ученого. Пока нет никаких подтверждений того, какой была истинная цель Хэ, пишет журнал.

В очередной статье о CCR5 для журнала Cell Силва и его коллеги из США и Израиля пишут, что отсутствие гена вследствие естественных мутаций у людей ускоряет восстановление после инсульта; кроме того, в университете Силвы ведутся испытания препарата против ВИЧ маравирок, который блокирует работу CCR5, для улучшения когнитивных способностей людей. Силва, комментируя эти работы изданию, подчеркнул методическую и этическую разницу между корректированием проблем у пациентов и усилением естественных способностей. Он подчеркнул, что хотя исследования на мышах показывают, что потенциально такое усиление возможно, из-за недостатка информации человечество пока не готово к экспериментам на людях.

Источник: https://nplus1.ru/news/2019/02/22/crispr-babies-brains

Китайский генетик Хэ Цзянькуй с помощью метода CRISPR/Cas отредактировал геном человеческих эмбрионов, впервые в мире родились генетически-отредактированные дети, близняшки Лулу и Нана. Это безопасно? И если да, то когда технология будет доступна для широкого применения?

Научный журналист «Лабы» Андрей Бычков обсудил эти вопросы с Денисом Ребриковым, доктором биологических наук, проректором Медицинского Университета имени Пирогова, заведующим лабораторией редактирования генома Научного центра имени Кулакова.

Запись эфира можно посмотреть здесь. А если нет времени, то ниже вы найдете краткий пересказ беседы, которая состоялась в программе «Ученый свет» на радио «Говорит Москва».

Рождение китайских «ГМО-близняшек»: это научный прорыв?

С технологической стороны эксперимент Хэ прорывом не является. Мы давно умеем делать и делаем направленное редактирование генома животных. Эта технология хорошо «обкатана» на растениях и животных, используется уже более 40 лет. Правда, для редактирования используются разные инструменты. Тот, который использовал Хэ, – CRISPR/Cas – относительно новый.

Революционность заключается в том, что впервые была отредактирована клетка будущего эмбриона, и после этого родились дети. Ну и в том, что об этом было рассказано публично.

Может быть, ученый рановато сообщил о своем успехе?

Это не главный вопрос к исследователю. Его коллег по всему миру больше интересует, например, какую научную и медицинскую целесообразность он преследовал? Ведь отец девочки был ВИЧ-положительный, а мать – отрицательна. Современная медицина умеет в таких случаях (благодаря ЭКО и антиретровирусной терапии) с вероятностью 99% исключать ВИЧ у ребенка. Поэтому выбор именно такого объекта для редактирования генома кажется не до конца понятным.

Редактирование генома человека – это вообще морально?

Наука – это попытка объективно, шаг за шагом описать, как устроен мир. Мораль, нравственность также изменяются, но со временем. Более того, в разных местах на планете существуют разные представления о морали.

Так что если это будет нужно для лечения серьезных болезней, принципы морали будут пересмотрены.

Редактирование генома – это естественный процесс? Происходит ли он в природе?

Да, безусловно. Изменение генома может происходить случайно, мы называем это мутациями, и благодаря им происходит эволюция на планете. Бывают и более целенаправленные (опять же, возникшие эволюционно) «редакции». Например, вирусы встраиваются в ДНК клеточных организмов, таким образом изменяя ДНК хозяина.

Какой человеческий ген изменил Хэ?

Исследователи некоторое время назад заметили, что существуют люди, которые не заражаются ВИЧ даже при контакте. В Северной Европе таких людей несколько процентов! Выяснилось, что они отличаются особым белком-рецептором.

Китайский исследователь поменял ген рецептора, чтобы на всю жизнь защитить девочек от заражения ВИЧ.

Так как в природе уже существует такой вариант гена, то он всего лишь поменял один естественный вариант гена на другой естественный вариант гена.

Какие могут быть проблемы со здоровьем у этих девочек?

Существуют методики проверки, не был ли внесен сбой в других местах ДНК при редактировании. Это делается с помощью полногеномного секвенирования. Теоретически, если бы таковые изменения были, то мы могли ожидать неких непредсказуемых последствий. Но Хэ не продемонстрировал, что таких изменений нет.

Какой инструмент редактирования ДНК использовался? Насколько это сложно?

Для редактирования была использована технология CRISPR/Cas. Технология CRISPR/Cas в данный момент стала довольно рутинной для лабораторного использования. То есть, например, можно купить коммерческие наборы для редактирования ДНК мышей.

Есть ощущение, что технология совсем недалека от клинического применения.

А какие могут быть еще применения CRISPR/Cas в клинической практике?

На сегодня найти применение для CRISPR/Cas-редактирования именно на уровне эмбриона не так просто. Потому что метод ЭКО и так позволяет отбирать эмбрионы с нужными генетическими характеристиками. Применение CRISPR/Cas могло бы быть оправдано в случае, если, скажем, 100% детей у конкретных родителей были бы больными (то есть оба родителя — носители одинаковых аллелей генов). Гораздо более интересным представляется применение CRISPR/Cas для лечения мультифакторных заболеваний, но пока такое невозможно.

Когда ждать массового применения CRISPR/Cas для лечения людей?

Это вопрос ближайших 5-10 лет.