Проект «Розетта» поможет подобрать блокаторы агрегации для белков
Рис. 1. Схема, по которой исследователи подбирали подходящий блокатор агрегации для белка тау. По той же схеме подбирался блокатор и для 248PAP286. Вначале в белке идентифицируется участок — половинка застежки-молнии, который склонен к агрегации (identify steric-zipper segment). Затем проверяется, в самом ли деле этот участок способен образовывать фибриллы и микрокристаллы (confirm segment forms fibrils and microcristals). После этого определяется атомная структура этого участка (determine atomic structure) и под эту структуру подбирается ингибитор (design ingibitor), который бы «застегивал» эту молнию. И наконец, in vitro подтверждается, что в присутствии ингибитора белок не образует фибрилл (Test ingibitor in vitro). Изображение из обсуждаемой статьи в Nature
Если белок неправильно сложился, не приобрел верную конформацию (см. Фолдинг белка), он может начать слипаться с себе подобными, неверно сложенными белками, что приводит к образованию белковых агрегатов. Такие агрегаты характерны для многих болезней (в основном нейродегенеративных, см. Neurodegeneration). Пока что нельзя определенно сказать, губят ли они клетки, в которых находятся, или, наоборот, спасают от неминуемой гибели (см. Нейрофибриллярные клубки при болезни Альцгеймера — не убийцы, а защитники клеток?, «Элементы», 15.05.2010). Однако связь между болезнью и возникновением белковых агрегатов несомненно существует, и поэтому эти агрегаты сейчас бурно изучаются. В том числе проводятся попытки с помощью различных ухищрений остановить белковую агрегацию. Один из способов это сделать описан в статье, опубликованной в журнале Nature.
Есть несколько моделей, объясняющих, как именно происходит агрегация белка. Одна из них предполагает, что в некоторых белках есть определенные участки (имеющие β-конформацию), которые обладают трехмерной структурой, напоминающей кусок пазла с выемками или половинку застежки-молнии. Эти участки «застегиваются» с аналогичными участками на другой белковой молекуле, и по этой причине и начинает расти фибрилла.
Из этого следуют два вывода. Во-первых, в образовании агрегатов повинен не весь белок целиком, а только короткие его фрагменты. А во-вторых, если подобрать какое-то вещество, которое будет обладать «застежкоподобной» пространственной структурой, идеально подходящей под структуру таких злокозненных фрагментов, то оно сможет закрыть собой эти фрагменты, предотвратить их слипание и таким образом остановить агрегацию.
Подбором такого вещества и занялась группа ученых под руководством Дэвида Эйзенберга (David_Eisenberg), известного американского биохимика, который сыграл важную роль в развитии компьютерных методов молекулярной биологии.
В фокусе внимания ученых оказались два коротких «застежкоподобных» участка из двух склонных к агрегированию белков.
Первый из них — это шестиаминокислотный пептид VQIVYK (заглавные латинские буквы — это имена аминокислот), фрагмент белка тау, внутриклеточные агрегаты которого наблюдаются при болезни Альцгеймера. Показано, что этот фрагмент имеет большое значение для возникновения тау-агрегатов, а кроме того, сам по себе может образовывать фибриллы, сходные по своим свойствам с фибриллами целого белка.
А второй, тоже шестиаминокислотный, пептид GGVLVN — фрагмент простатической кислой фосфатазы, или РАР (см. Prostatic acid phosphatase) — белка, который в больших количествах встречается в семенной жидкости. Показано, что фибриллы, образованные его участком 248PAP286, сильно повышают риск заражения СПИДом. Изучаемый в данной работе пептид GGVLVN был фрагментом именно 248PAP286.
Чтобы подобрать подходящий ингибитор изучаемых пептидов, исследователи использовали специальное программное обеспечение под названием Rosetta («Розетта»), которое позволяет смоделировать пространственную конфигурацию белка на основе его аминокислотной последовательности и наоборот — подобрать аминокислотную последовательность, которая будет образовывать необходимую пространственную конфигурацию.
В результате исследователям удалось подобрать искусственный пептид D-TLKIVW (где D обозначает, что все аминокислоты в этом пептиде находятся в D-конфигурации, то есть являются оптическими изомерами, зеркальными отражениями привычных L-аминокислот). Этот пептид по своей пространственной конфигурации идеально подходил к VQIVYK, «пристегивался» к нему и не позволял «пристегнуться» следующим слоям VQIVYK, таким образом останавливая образование фибрилл. В опытах in vitro было показано, что агрегация прекращается не только у самого VQIVYK, но и у более длинных фрагментов белка тау, содержащих VQIVYK.
Рис. 2. При добавлении пептида D-TLKIVW к раствору К12 (это фрагмент белка тау, содержащий VQIVYK-последовательность) агрегация не начинается даже в присутствии затравки (seed), коричневая линия. Без D-TLKIVW или с пептидом, у которого аминокислоты расставлены не в том порядке (D-TIWKVL), агрегация начинается очень быстро (черная и зеленая линии). По горизонтальной оси — время в часах. По вертикальной оси — уровень агрегации, измеренный по флуоресценции тиофлавина S (см. Thioflavin), флуоресцентной краски, которая специфически связывается с фибриллами. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature.
Чтобы понять, как именно работает полученный пептид, исследователи «прогнали» его по серии тестов. Они меняли местами его аминокислотные остатки, заменяли D- на L- аминокислоты, и проверяли, работает ли он с другими белками, которые не содержат последовательности VQIVYK. В результате выяснилось, что D-TLKIVW работает лучше, чем L-TLKIVW; что перепутывание аминокислот в пептиде приводит к потере его свойств; и наконец, что этот пептид согласен связываться только с VQIVYK-последовательностью и никак не влияет на агрегацию белков, которые ее не содержат (это последнее свойство пептида очень радует, так как говорит о том, что он не будет нарушать агрегацию белков, которые в норме и должны образовывать фибриллы).
При этом, что особенно важно, было обнаружено, что D-TLKIVW связывается именно со строгоструктурированными VQIVYK-фибриллами, а не с растворимыми в воде мономерами VQIVYK-пептида, которые имеют не столь жесткую пространственную конфигурацию. Иными словами, пептид работает именно потому, что он специфически, очень точно подходит к агрегатогенному участку белка, что и было предсказано с помощью компьютерного моделирования его структуры.
Аналогичным образом ученые подобрали и второй пептид — ингибитор агрегации для GGVLVN, фрагмента простатической кислой фосфатазы. Этот пептид, Trp-His-Lys-chAla-Trp-hydroxyTic, был назван исследователями WW61. В его состав, помимо «классических», пептидогенных, аминокислот, входили и «нестандартные», которые не встречаются в белках, — chAla (производное аланина) и hydroxyTic (гигантское производное пролина и тирозина).
WW61 тоже отлично предотвращает образование агрегатов in vitro, причем не только у короткого пептида GGVLVN, к которому он «подогнан», но и у более длинного участка белка, 248PAP286, в состав которого и входит GGVLVN.
Поскольку фибриллы, образованные участком 248PAP286 в семенной жидкости, увеличивают риск ВИЧ-инфекции, ученые решили проверить, не сможет ли WW61 уменьшить этот риск. Для этого они обработали ВИЧ-частицы раствором 248PAP286, который перед этим был выдержан в течение 20 часов (чтобы началось образование фибрилл) в присутствии или в отсутствие WW61, а затем попробовали заразить ими культуру клеток. Результаты были просто феерическими — WW61 практически предотвращал заражение.
В этой работе прекрасны не столько полученные прикладные результаты (например, большой вопрос, стоит ли вообще останавливать агрегацию тау и не принесет ли это больше вреда, чем пользы), сколько сам подход к проблеме. Разработанная методика позволяет подобрать блокаторы агрегации для множества белков. А кроме того, данная работа служит весомым аргументом в пользу того, что «застежкоподобные» участки играют важную роль в образовании фибрилл.
Источник: Stuart A. Sievers, John Karanicolas, Howard W. Chang, Anni Zhao, Lin Jiang, Onofrio Zirafi, Jason T. Stevens, Jan Münch, David Baker, David Eisenberg. Structure-based design of non-natural amino-acid inhibitors of amyloid fibril formation. // Nature. 2011. V. 475. P. 96–100.
Вера Башмакова http://elementy.ru/novosti_nauki/431629
www . bionc . ru
